Возможности повышения эффективности противовирусной терапии и профилактики ОРВИ. Новые экспериментальные данные на клеточных культурах

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются наиболее массовыми заболеваниями, на их долю приходится до 90% всей инфекционной патологии. Наибольшую эпидемическую значимость представляют вирусы гриппа А и B. Тем не менее возбудители, относящиеся к различным семействам, отличающиеся по морфологии и генетической характеристике, но вызывающие сходные по клинической картине заболевания, вносят ощутимый вклад в общую картину респираторных инфекций, обеспечивая стабильный уровень заболеваемости в межэпидемический по гриппу сезон. При этом в качестве этиологических агентов наиболее часто имеют место вирусы парагриппа, респираторно–синцитиальный вирус, адено– и коронавирусы. Ретроспективный анализ и современные данные показывают, что эта тенденция в общих чертах сохраняется в разные годы и на различных территориях (рис. 1) [1–3].

Рис. 1. Этиологическое распределение ОРВИ в России
в эпидемический сезон 2010–2011 гг., по данным
Федерального Центра по гриппу (НИИ гриппа) [2].
Все типы гриппа – 29,1%, все ОРВИ, кроме гриппа – 70,1%

В структуре острых инфекций дыхательных путей вирусы парагриппа составляют около 20% у взрослого населения и 30–40% у детей раннего возраста, уступая по частоте только респираторно–синцитиальному вирусу в качестве этиологического фактора поражений нижнего отдела дыхательного тракта [1]. Вирусы парагриппа относятся к группе РНК–содержащих парамиксовирусов размерами 100–300 нм. В настоящее время известны 4 типа вирусов парагриппа, выделенных от человека. Им не свойственна, как вирусам гриппа, вариабельность антигенной структуры. У большинства больных парагрипп протекает как кратковременное заболевание (не более 3–6 дней) без выраженной общей интоксикации. Однако заболевания могут протекать в форме крупа, бронхиолитов и пневмонии. 1–й и 2–й типы парагриппа чаще всего ассоциируются с крупом, тогда как наиболее патогенный вирус парагриппа 3–го типа чаще других типов парагриппа обусловливает бронхиты, бронхиолиты, пневмонии. Особенно уязвимы для парагриппа дети 1–го года жизни. В связи с этим необходимо отметить роль парагриппозной инфекции в смертности детей раннего возраста и иммуносупрессивных взрослых пациентов, поскольку, осложняясь бактериальной инфекцией, она является причиной смертности от инфекций нижних дыхательных путей в 25–30% случаев в этих группах. Реинфекция парагриппа возможна на протяжении всей жизни, приобретая особое значение у иммуносупрессивных пациентов, расширяет этот круг неблагополучная экология, стрессовые условия жизни мегаполисов.

Респираторно–синцитиальный вирус, также относящийся к семейству РНК–содержащих парамиксовирусов, является важным патогеном инфекций нижних дыхательных путей младенцев. Отмечается, что от 80 до 90% всех младенцев пережили по крайне мере один эпизод РС–вирусной инфекции, от 0,5 до 2% прошли лечение в больнице [4]. По наблюдениям этих авторов, у 30% взрослых, перенесших в детстве РС–вирусную инфекцию, развивалась бронхиальная астма по сравнению с 3,8% в контрольной группе.

Аденовирусы и коронавирусы, являясь непременными участниками эпидемического процесса, в структуре ОРВИ составляют до 50 и до 20% соответственно [5].

Аденовирусы – ДНК–содержащие, безоболочечные вирусы диаметром до 80 нм – насчитывают более 50 серотипов, которые отличаются по эпидемиологическим особенностям и тропности к различным тканям. Поэтому спектр вызываемых ими поражений достаточно широк: воспалительные заболевания носоглотки, конъюнктивы, мочевого пузыря и желудочно–кишечного тракта. Отмечается, что при острых кишечных инфекциях у детей аденовирусы выделяются с частотой до 7,5% [6]. Мы остановили свой выбор на аденовирусе 3–го серотипа ввиду его большого эпидемического значения как возбудителя назофарингеальной лихорадки. Что касается коронавирусов, РНК–содержащих вирусов, имеющих в составе вириона липопротеиновую оболочку и размер около 120 нм, они так же, как аденовирусы, помимо эпителия дыхательных путей имеют тропность к эпителию желудочно–кишечного тракта. Особенно уязвимы к коронавирусной инфекции дети младшего возраста, у которых катаральные явления в преобладающем большинстве случаев сочетаются с диарейным синдромом [5].

В отношении респираторных вирусных инфекций следует отметить, что антивирусная терапия актуальна в группах повышенного риска и при тяжелом течении заболевания. Так, рибавирин назначается пациентам с факторами риска и тяжелом течении РС–вирусной инфекции [1]. В остальных случаях терапия острых респираторных вирусных инфекций направлена главным образом на основные звенья патогенеза. Поиск средств, которые при минимальных побочных эффектах облегчали бы течение заболевания и сокращали его сроки, является актуальной задачей. Не менее актуальной проблемой применения этиотропных препаратов является быстрое появление и селекция устойчивых к ним штаммов. Так, ремантадин, кроме того, что он неэффективен против гриппа В, в последние эпидсезоны не действовал на значительную часть вирусов подтипа А(Н3N2).

Сезонные вирусы подтипа А(Н1N1), напротив, были в большинстве чувствительны к ремантадину, но быстрыми темпами приобретали устойчивость к озельтамивиру [7]. Пандемический штамм 2009 г. A(H1N1)pdm чувствителен к озельтамивиру и устойчив к ремантадину [8].

Все это является основанием для поиска препаратов, не направленных на вирус как таковой или его взаимодействие с клеткой, а стимулирующих клеточную резистентность, выработку интерферонов, иммунную защиту. Вследствие этого остается актуальным использование неспецифических препаратов против ОРВИ, включая растительные и гомеопатические препараты.

Одним из таких препаратов является Инфлюцид («Дойче Хомеопати–Унион»), имеющий следующий состав: 100 г раствора содержит Aconitum D3 10g, Gelsemium D3 10g, Ipecacuanha D3 10g, Phophorus D5 10g, Bryonia D2 10g, Eupatonum perfoliatum D1 10g. Прочие ингредиенты: Eucalyptus globules, 96% этанол, вода очищенная. Содержание алкоголя 45 об.%. Выпускается как представленная выше жидкая, так и таблетированная форма препарата. По данным литературы, Инфлюцид существенно снижает такие симптомы, присущие всем ОРЗ, как гипертермия, боли в конечностях, кашель, гиперемия слизистых, воспалительные процессы в глотке и гортани [9]. In vitro показано стимулирующее действие препарата на продукцию клетками интерферона [10].

Ранее нами продемонстрировано противовирусное действие Инфлюцида in vitro в отношении целого ряда актуальных штаммов гриппа – сезонных штаммов А(H1N1) и пандемического штамма 2009 г. –A(H1N1)pdm, A(H3N2), A(H5N1) и В, а также вирусов герпеса человека 1–го и 2–го типов и аденовируса III типа [11–13]. Препарат не только снижал продукцию вирусных частиц при оценке методом реакции гемагглютинации (РГА), но и увеличивал резистентность клеток в культуре к цитопатогенному действию вирусов при оценке клеточной жизнеспособности и дыхательного метаболизма методом МТТ [12,13]. Кроме того, показано достоверное снижение смертности мышей, зараженных летальной дозой вируса гриппа А/PR/8/34, при лечебно–профилактическом введении клинически адекватных доз Инфлюцида [11].

Задачей настоящей работы было сравнительное исследование in vitro действия Инфлюцида в отношении эталонных штаммов парагриппа, корона– и РС–вирусов, а также возможного цитопротекторного действия препарата в отношении токсичности, вызванной высокими концентрациями распространенных противовирусных препаратов ремантадина и арбидола. В работе использованы эталонные штаммы вирусов, полученные из Музея вирусов ОРЗ ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития: HPIV–3/2235, HCoV–lp/3482, RSV/4317, а также HSV1/SPb/248/88 и HSV2/etalon/2000. В качестве культур клеток использованы А–549 (эпителиодная линия, происходящая от карциномы легкого человека) и L–41 (макрофагальная линия человека моноцитарно–лейкемического происхождения).

Цитопатогенное действие вирусов учитывалось в инвертированном микроскопе. Вторым важным индикатором защитного действия препарата служила реакция восстановления клетками в культуре тетразолиевого красителя МТТ (Тиазолила голубого), интенсивность которой отражает степень жизнеспособности клеток в результате восстановления красителя митохондриальными и частично цитоплазматическими дегидрогеназами.

Тест часто используется в вирусологии для оценки цитопатогенного действия вирусов на клетку [14]. Его результаты можно интерпретировать как степень устойчивости клеток к действию вирусов. Микротетразолиевый тест также широко используется в оценке воздействия на клетки токсикантов, фармакологических препаратов, неблагоприятных факторов окружающей среды [15], поэтому одновременно с противовирусным эффектом можно оценивать токсичность исследуемых препаратов in vitro. Инфлюцид вводили в среду культивирования клеток за 6–24 ч до заражения вирусом («профилактическая» схема введения) и одновременно с заражением вирусом («лечебно–профилактическая» схема введения) в разведении на буфере PBS 0,125–0,5% (концентрация в среде исходного жидкого препарата).

Результаты исследования

Противовирусное действие различных концентраций Инфлюцида в отношении аденовируса III типа при вирусной нагрузке 10 тканевых инфекционных доз представлено на рисунке 2. В качестве критерия жизнеспособности клеток в культуре показана оптическая плотность в МТТ–тесте. Как видно из рисунка 2, существует оптимальная концентрация, при которой действие препарата наиболее эффективно. Для дальнейших исследований нами была выбрана минимальная из эффективных концентраций препарата – 0,125%.

Рис. 2. Противовирусное действие Инфлюцида на аденовирус
3–го типа в культуре L–41. Вирусная нагрузка 10 ТИД50

Противовирусное действие Инфлюцида в отношении исследованных вирусов ОРВИ при лечебно–профилактическом введении показано на рисунке 3. В качестве критерия эффективности представлена разница логарифма титра вируса в контроле (без препарата) и опыте – logТИД50. Как правило, в вирусологических исследованиях logТИД50≥2,0 считается удовлетворительным противовирусным эффектом. Таким образом, препарат оказался эффективным против всех исследованных вирусов.

Рис. 3. Действие Инфлюцида (0,125%) в отношении вирусов
ОРВИ при одновременном внесении в культуру препарата
и вируса («лечебно–профилактическое»)

Как и следовало ожидать, в случае предынкубации клеточных культур с Инфлюцидом и последующего заражения соответствующими вирусами защитный эффект препарата оказался еще более выраженным (рис. 4).

Рис. 4. Действие Инфлюцида (0,125%) в отношении
вирусов ОРВИ и герпеса при внесении в культуру за 6 ч
до заражения клеток («профилактическое»)

Разница титра вируса с контролем для большинства исследованных вирусов превышает 2,5 и даже 3, что может считаться для препарата широкого спектра действия очень хорошим результатом. На рисунке 4 мы не случайно представили данные не только по ОРВИ, но и по вирусам герпеса. В свете показанного ранее стимулирующего действия препарата на продукцию клетками интерферона [10] представляет большой интерес высокая эффективность Инфлюцида против вируса герпеса II типа, поскольку инфекция последним связана с иммунодефицитными состояниями: заболевание, обусловленное вирусом простого герпеса, в клинической практике встречается как инфекция, осложняющая иммунодефицитные состояния различной этиологии, так и в качестве самостоятельного заболевания, которое расценивается как вторичный иммунодефицит. Многочисленными исследованиями доказано, что вирус герпеса II типа вызывает значительно более выраженные и разносторонние иммунологические нарушения сравнительно с вирусом I типа, обусловливая частые рецидивы, зачастую резистентные к проводимой этиотропной терапии [16].

Следующая часть нашей работы была посвящена возможному защитному действию Инфлюцида в отношении токсического ответа клеток в культуре на высокие дозы противовирусных препаратов ремантадина и арбидола. Предпосылкой данного исследования послужило то, что противовирусное действие Инфлюцида in vitro: 1) является неспецифическим; 2) в качестве основного механизма имеет цитопротекторное действие, т.е. защиту клеток от цитопатического воздействия вируса.

На рисунке 5 показаны 96–луночные планшеты (культуры L–41 и А–549) при воздействии убывающих концентраций ремантадина с раститровкой 1:1,4 (верхние 4 ряда) и тех же концентраций ремантадина в присутствии Инфлюцида (0,125%). Инфлюцид вносили по «профилактической» схеме. Окраска – методом МТТ. Как видно на рисунке 5, при пограничных концентрациях ремантадина, уже достаточно токсичных, но еще не убивающих все клетки, очевиден защитный эффект Инфлюцида. Это подтверждается количественной обработкой данных спектрофотометрии планшет на анализаторе Vario scan при характеристической длине волны 550 нм (рис. 6) – практически при всех токсичных концентрациях реман тадина наблюдался достоверный защитный эффект Инфлюцида.

Рис. 5. Защитное действие Инфлюцида (0,125%)
в отношении токсичности, вызванной высокими
концентрациями ремантадина в культуре клеток L–41.
Тест–метод – МТТ, внешний вид планшет

Рис. 6. Защитное действие Инфлюцида (0,125%)
в отношении токсичности, вызванной высокими
концентрациями ремантадина в культуре клеток L–41,
данные фотометрии

Аналогично Инфлюцид действует in vitro против токсичности, вызванной современным противогриппозным препаратом арбидолом (рис. 7 и 8). Следует подчеркнуть, что как ремантадин, так и Арбидол брали в этом исследовании в заведомо завышенных концентрациях по сравнению с их терапевтическими дозами. Однако важным следствием обнаруженного эффекта является возможность сочетанного применения Инфлюцида с этими препаратами при ОРВИ, причем их дозы могут при этом быть увеличены без риска возникновения побочных эффектов.

Рис. 7. Защитное действие Инфлюцида (0,125%)
в отношении токсичности, вызванной высокими дозами
Рис. 8. Защитное действие Инфлюцида (0,125%)
в отношении токсичности, вызванной высокими дозами
арбидола в культуре клеток А–549, данные фотометрии

Выводы

1. Инфлюцид обладает in vitro противовирусной активностью в отношении широкого спектра вирусов, вызывающих ОРВИ: аденовирусов, коронавирусов, респираторно–синцитиальных вирусов и вирусов парагриппа.

Препарат оказался особенно эффективен при профилактическом введении за 6–24 ч до заражения клеток.

2. Большой интерес в свете показанного ранее интерферон–стимулирующего действия Инфлюцида представляет высокая эффективность препарата in vitro против вирусов простого герпеса, особенно 2–го типа, связанных с развитием вторичных иммунодефицитов.

3. Кроме противовирусного эффекта Инфлюцид обладает общим цитопротекторным действием, защищая клетки в культуре от токсического воздействия высоких концентраций противовирусных препаратов ремантадина и арбидола.

Литература

1. Subhash Chandra Parija http://emedicine.medscape.com/article/224708–overview/Updated:Apr 19, 2010.
2. www.influenza.spb.ru
3. Голованова А.К., Ревунова О.В., Цыбалова Л.М. и др. Этиологическая структура респираторных вирусов в Санкт–Петербурге и Ленинградской области по результатам их изоляции в 1997–2000 г.г. // В сб.: Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций. СПб., апрель 2001, С.16–18.
4. Ruotsalainen М. et al. Respiratory morbidity in adulthood after respiratory syncytial virus hospitalization in infancy. // Pediatr. Infect Dis. J. – 2010. – V. 29(9). – P. 872–974.
5. Смирнов В.С. Современные средства профилактики и лечения гриппа и ОРВИ. –СПб., «ФАРМиндекс» – 2003. – 50С.
6. Козина Г.А. Клинико–эпидемиологические особенности и вопросы терапии острых кишечных инфекций аденовирусной этиологии F 40/41 у детей. / Автореф. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. М., 2010г.
7. Еропкин М.Ю., Грудинин М.П., Коновалова Н.И. и др. Антигенные и генетические особенности современных вирусов гриппа в России // Материалы I Всероссийского Ежегодного Конгресса по инфекционным болезням. М., 30 марта–01 апреля, 2009. – С. 67.
8. Киселев О.И., Комиссаров А.Б., Стукова М.А. и др. Пандемический грипп 2009 г. в России. Диагностика и молекулярно–биологические характеристики вируса // Вопр. вирусологии. – 2011. – Т. 56. – № 1. – С. 17–21.
9. Гаращенко Т.И., Гаращенко М.В., Мезенцева М.В. Клинико–иммунологическое обоснование гомеопатических препаратов в профилактике и лечении гриппа и ОРВИ // Русский медицинский журнал.–2005.–Т.13.–№13.–С.1432–1437.
10. Ершов Ф.И. Рациональная фармакотерапия гриппа и ОРВИ // Фарм. вестник. – 2003. – №33(312).
11. Еропкин М.Ю., Григорьева В.А., Гудкова Т.М. и др. Активность препарата «Инфлюцид» в отношении вирусов гриппа в модельных системах // МЕДЛАЙН–Экспресс. – 2007. – № 6. –С.23–26.
12. Еропкин М.Ю., Коновалова Н.И., Григорьева В.А., Байбус Д.М., Гудкова Т.М. Действие препарата Инфлюцид in vitro против пандемического штамма 2009 г. A(H1N1) «свиного» («мексиканского») гриппа // Традиционная медицина – 2009. – № 3(18). – С. 14–18.
13. Еропкин М.Ю., Гудкова Т.М., Даниленко Д.М. и др. Пандемический грипп 2009 г. в России: антигенные, биологические свойства и чувствительность к противовирусным препаратам // Русский медицинский ж. – 2010. – Т. 18, № 7. – С.410–415.
14. Watanabe W., Konno K., Ijichi K., et al. MTT colorimetric assay system for the screening of anti–orthomyxo and anti–paramyxoviral agents // J. Virol. Methods. 1994. Vol. 48 No.2–3 P. 257–265.
15. Borenfreund Е, Babich H, Martin–Alguacil N. Comparison of two in vitro cytotoxicity assays – the neutral red (NR) and tetrazolium (MTT) tests // Toxicol. In Vitro. – 1988. Vol. 2 No. 1. P. 1–6.
16. Брязжикова Т.С. Герпетическая инфекция: профилактика и лечение // Врач. – 2004. – №2. – С.47–48.

Вопросы, ответы, комментарии