Резкое повышение прооксидантного статуса тканей крыс при острой интоксикации циклофосфамидом (Теоретическая медицина)

Ключевые слова: кровь, циклофосфамид, металлопротеины  

 Циклофосфамид (ЦФ) является цитостатиком, используемым при химиотерапии онкологических заболеваний различной этиологии подавления роста опухолевых клеток. Однако ЦФ вызывает деградирующий  эффект на нормальных клетках, почечную недостаточность, нарушение работы легких, подавление продуцирования эритроцитов и лейкоцитов в костном мозге, снижает транспорт кислорода эритроцитами, нарушает функционирование нуклеиновых кислот, В-  и Т-клеток, подавляет процесс продуцирования антител в сыворотке [6,9] и оказывает иммуносупрессорное воздействие [4].  С другой стороны, ЦФ нормализует экспрессию интерлейкина (ИЛ)-12, ИЛ-4, ИЛ-5 и снижает уровень интерферона у больных мультиплетным склерозом [5].ЦФ вызывает апоптоз СОV434 гранулоцитов человека, который приводит к оксидативному стрессу и истощению глутатиона [11], подавляет активность тиоредоксин редуктазы в ткани мочевого пузыря [13]. В результате введения крысам 15 мг/кг ЦФ (посредством желудочного зонда 1 раз еженедельно, в течение 10 недель) наблюдается оксидативное повреждение спермы крыс, а при 35 мг/кг липоевой кислоты, введенной в аналогичном режиме, играет антистрессорную роль, регулируя уровень СОД, каталазы, глутатион пероксидазы и снижая степень поврежденности ДНК [7]. Мелатонин также оказывает протективный эффект, улучшая состояние ткани мочевого пузыря [10].Вызванные ЦФ нарушения гомеостаза возвращаются к норме спустя некоторое время после окончания курса лечения.

Известно, что одним из механизмов действия иммунной системы является нейтрализация антигенов продуцируемыми активными формами кислорода (АФК), которые образуются комбинированным ферментом НАДРН-оксидазой, состоящей из пяти изоформ цитохрома (цит) b₅₅₈ и локализованной в мембране и цитозоле иммунных клеток [12]. C другой стороны, новые 5 изоформ цит b₅₅₈ присутствуют  в эритроцитарных мембранах (ЭМ) и сыворотке крови млекопитающих и рыб [2]. Причем цит b558III ЭМ обладает активностью автономного продуцирования супероксидных радикалов (О^-₂) и восстановления ферригемоглобина (ферриНb) [8]. 

Исходя из этого появляется необходимость определения О^-₂ -продуцирующей и метHb-восстанавливающей активности цит b₅₅₈III, а также  уровня и активности других ключевых металлопротеинов (МП) крови, печени и селезенки белых крыс при острой интоксикации ЦФ.

Целью работы явилось определение  характерных изменений уровня и активности МП, регуляторов метаболизма АФК в тканях крыс под влиянием внутрибрюшинно введенного ЦФ.

Материал и методы

Белые половозрелые крысы обоих полов (200-220г) были разделены на две группы (по 12 крыс). В опытной группе крысам вводили внутрибрюшинно по 40 мг/кг ЦФ (с 0,5 мл физраствором) ежедневно, в течение 6 дней. Группа контрольных животных получала физраствор в аналогичном режиме. Крыс декапитировали через 2 недели под легким эфирным наркозом. Кровь (по 20 мл) стабилизировали 2% оксалатом натрия. Печень (по 10 г) и селезенку (по 3 г) гомогенизировали в 0,04 М калий фосфатном буфере рН 7,4 (КФБ). Далее осуществляли одновременное получение МП из этих проб крови. МП антиоксидантной активности – МАА (Cu,Zn-СОД и каталаза из цитозоля эритроцитов, церулоплазмин и трансферрин – из сыворотки крови) и МП прооксидантной активности – МПА (2 новые изоформы цит b₅₅₈ из ЭМ, О^-₂-продуцирующий липопротеин сыворотки–  супрол), а также цит b5 из цитозоля эритроцитов получали аналитическим биотехнологическим способом, без использования детергента для солюбилизации ЭМ  цит b₅₅₈ [3], так как детергент существенно снижает стабильность этих гемопротеинов. Для получения МАА и МПА белковые фракции сыворотки крови, ЭМ  и цитозоля эритроцитов после диализа против воды подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах DE-52, KM-52 («Whatman», Англия) и на сефадексе DEAE A-50 («Pharmacia», Швеция) и гель-фильтрации на сефадексах G-75, G-150. МАА и МПА из печени и селезенки получали аналогичным образом, путем ионообменной хроматографии белковых фракций цитозоля и мембран клеток на целлюлозах DE-52, KM-52.   

Количество МП определяли оптическим спектральным методом, путем измерения плотности характерного максимального оптического поглощения для цит b₅  при 525 нм, изоформ цит b₅₅₈ – 530нм, супрола – 430нм, церулоплазмина – 610нм и трансферрина – 470нм, цитохрома С–520нм. Супероксиддисмутазную (СОД) активность и О^-₂-продуцирующую активность супрола и цит b₅₅₈III в гомогенной и гетерогенной  фазе (в мембранах) определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента ингибирования (в случае СОД) или стимулирования  образования формазана (при 560 нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД активности или  продуцирующей активности принимали количество белка, которое соответственно подавляет или стимулирует образование формазана на 50%. 

Метгемоглобин (метHb)-восстанавливающую активность цит b₅₅₈III определяли, используя свежеполученный метHb (ферриHb) крови крыс с величиной плотности максимального оптического поглощения альфа-полосы (при 565 нм) 0,8. При этом величина плотности максимального оптического поглощения бета-полосы цит b₅₅₈III в реакционной смеси составляла 0,03. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3 мл раствору  метHb добавляли 0,2 мл цит b558III (с А530 = 0,45). После быстрого перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16 ч при 25-30⁰C .После повторного перемешивания смеси определяли кинетику восстановления ферриHb до ферроHb путем измерения снижения плотности альфа-поглощения ферриHb (это снижение прямо пропорционально образовавшемуся ферроHb, который имеет поглощение при 565 нм). Для определения метHb-восстанавливающей активности цит b₅₅₈ в гетерогенной фазе (в ЭМ) к ферриHb добавляли 0,2 мл ЭМ (мембраны клеток получали из 2 мл эритроцитов или из 1 г тканей и смешивали с 4 мл 0,04 М КФБ, рН 7,4).

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора перекиси водорода в присутствии и отсутствие каталазы. За единицу каталазной активности принимали то количество фракции (белка), которое расщепляет 0,1 М перекиси водорода в течение 1 мин при 20⁰C. 

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре «Specord М-40» (Германия) с длиной оптического пути 1 см. 

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности Р.

Результаты и обсуждение

Под влиянием ЦФ в приведенном режиме оксидативный стресс обусловлен характерным изменением уровня и активности МАА и МПА крови и тканей (селезенка и печень). Резкое увеличение уровня цит b5 в цитозоле эритроцитов скорее всего обусловлено существенной потерей подвижности животных в опытной группе (табл.1), такой эффект наблюдается на начальных этапах гипокинезии [1]. Существенное увеличение уровня сывороточных цит b₅₅₈I и цит b₅₅₈II  обусловлено действием адаптационных систем крови против перекиси водорода (эти гемопротеины обладают некоторой каталазамиметической активностью). Снижение уровня суммарной фракции цит b₅₅₈ ЭМ, видимо, обусловлено увеличением степени агрегации этих гемопротеинов, осложняю-

Таблица 1

Относительное изменение (%) уровня и активности МП крови, печени и селезенки  после острой интоксикации крыс под влиянием внутрибрюшинно введенного циклофосфамида, по сравнению со 100% контрольными показателями (Р< 0,05, n = 3)

щей процесс их отщепления. Из этих соображений можно предположить, что степень агрегации цит b₅₅₈ в мембранах клеток селезенки (МКС) снижена (из-за чего повышается уровень отщепленного из гетерогенной фазы в гомогенную фазу фракции цит b558). Фактор агрегации этих гемопротеинов в гетерогенной фазе (или снижение текучести ЭМ) действует и на НАДРН-зависимую О^-₂-продуцирующую активность цит b558III, которая снижена в  ЭМ,  но  увеличена  в  гомогенной  фазе. Однако О^-₂-продуцирующая активность цит b558 из МКС существенно снижена (табл.1). На этом фоне метНb-восстанавливающая активность цит b558 из ЭМ и фракция цит b558 из МКС заметно снижены. Снижение НАДРН-зависимой,О^-₂-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности цит b558 

ЭМ и особенно фракции цит b₅₅₈ МКС (селезенка является органом иммунной системы) свидетельствует о том, что ЦФ подавляет иммунную систему и кислородный гомеостаз (метHb не способен перенести молекулярный кислород к клеткам). С другой стороны, заметное снижение уровня НАДРН-содержащего О^-₂-продуцирующего липопротеина сыворотки супрола  (его О^-₂- продуцирующая активность не изменяется) считается положительным фактором, так как при этом сохраняется вязкость сыворотки и в целом микроциркуляция крови. Под влиянием ЦФ заметно снижается уровень сывороточного церулоплазмина (уровень трансферрина снижен в небольших количествах). При этом уровень отщепленного цит С из митохондрий печени существенно увеличен, тогда как этот процесс в селезенке подавлен. Активность Cu,Zn-СОД в цитозоле эритроцитов и суммарная Cu,Zn-CОД и Мп-СОД активность цитозоля печени и селезенки не изменяются, однако, активность каталазы в печени существенно снижена под влиянием ЦФ. 

Таблица 2

Относительное изменение (%) антиоксидантного статуса (АС) и прооксидантного  

статуса (ПС) компонентов крови при острой интоксикации крыс циклофосфамидом

Суммарный уровень приведенных МАА и МПА (включая и цит С) или антиоксидантного статуса (АС) и прооксидантного статуса (ПС) подвергается характерным изменениям при острой интоксикации крыс ЦФ (табл. 2). По сравнению с АС, ПС повышен больше в сыворотке, далее в эритроцитах, печени и, наконец, в клетках селезенки. В этой последовательности оксидативному повреждению подвергаются больше всего сыворотка крови, далее эритроциты и печень и меньше всего селезенка. Такое стрессорное состояние животных отражается и на степени выживаемости животных, что составляет  всего 65-70%. 

Предполагается, что при острой интоксикации крыс ЦФ механизмы иммуносупроссорного и отрицательного эффектов этого препарата на кислородный гомеостаз обусловлены снижением НАДРН-зависимой супероксид-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности цитохрома b558  из эритроцитарных мембран и мембран клеток селезенки.

Поступила 03.12.07

Литература

1. Акопян В.П., Симонян М.А., Манукян А.А., Симонян Р.М., Акопян А.А. Дисбаланс между уровнями металлопротеинов крови в ранние сроки гипокинезии у крыс. Бюл.эксп.биол.мед., 2001, 11, с. 527-529.
2. Симонян М.А., Бабаян М.А., Симонян Г.М. Цитохромы b558 из сыворотки крови и мембран эритроцитов. Выделение, очистка и краткие характеристики. Биохимия, 1995, т.60(12), с.1877-1987.
3. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобрет.N908 Армпатента. Ереван, 2001.
4. Colvin O.M. An overview of cyclophosphamide development and clinical applications,  Curr.Pharm.Des., 1999, .5(8), p.555-560.
5. Comabella M, Balashov K., Issazadeh Sh. et al. Elevated interleukin-12 in progressive  multiple sclerosis correlated with disease activity and is normalized by pulse cyclophospha- mide therapy, J.Clin.Invest., 1998, 102, p.671-678.
6. Schellekens P.T., Ten Berge R.J. The effects of immunosuppressive drugs on human immunocompetence, Pharm. Weekbl.Sci., 1984, 6(1),p.32-38.
7. Selvakumar E., Prahalathan C., Sudharsan P.T., Varalakshimi P. Chemoprotective effect of lipoic acid against cyclophosphamide-induced changes in the rat sperm, Toxicology, 2006, 17(1), 71-78.
8. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. The reduction of ferrihemoglobin by erythrocytes membrsnes cytochrome b558III at various pathological states in vitro, NAS RA Electronic J.of Natural Sciences, 2006, 2(7), p.3-6. 
9. Ten Berge R.J., Schellekens P.T. Immunesuppresive drugs in clinical medicine, Neth. J. Med., 1994, 45(6), p.329-338
10. Topal T., Oztas Y., Korkamaz A. et al. Melatonin ameliorates bladder damage induced by cyclophosphamide in rats, J.Pinecal.Res., 2005, 38(4), 272-277.
11. Tsai-Turton M., Luong B.T., Tan Y., Luderer U. Cyclophosphamide - induced apoptosis on COV434 human granulosa cells involves oxidative stress and glutathione depletion, Toxicol.Sci., 2007, 98(1), p.216-230.
12. Vignais P.V. The superoxide generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism, Cell Mol.Biol. Sci., 2002, 59(9), p.1428-1459.
13. Zhang J., Ma K., Wang H. Cyclophosphamide suppresses thioredoxin reductase in bladder tissue and its adaptive response via inductions of thioredoxin reductase and glutathione peroxidase, Chem.Biol.Interact., 2006, 162(1), p.24-30.

Вопросы, ответы, комментарии