Структурно-функциональные особенности вновь синтезированных тирозинпроизводных соединений антикоагулянтного действия

Ключевые слова:  свертываемость крови, тромбопластическая активность, синтетические соединения Н-30, Н-31, Н-32, адреналин, изопропилтирозин

Развитие гематологических исследований существенным образом оттенялось особым вниманием, подчеркивающим необходимость проведения широкомасштабных фундаментальных работ по выявлению и изучению регуляторных механизмов системы свертывания крови как в физиологически метаболизирующем организме, так и особенно при его различных болезненных состояниях. Применение ряда биологически активных соединений про- и антикоагулянтного действия проводилось с особым акцентированием важности выявления доселе неизвестных эндогенных факторов, ответственных за реализацию отдельных звеньев процесса гемокоагуляции. Вместе с тем подчеркивалась необходимость одновременного проведения сравнительной оценки эффективности действия последних и ряда синтетических соединений – активаторов и ингибиторов тромбообразовательного процесса.

Результаты наших ранее проведенных исследований [1,2,24-26] являются объективным подтверждением неоднократно наблюдавшегося факта в направленности сдвигов времени свертывания крови (ВСК) и научно признанных ингредиентов из серии регуляторов этого процесса – протромбинового времени (ПВ), тромбопластической активности (ТА), ионов кальция, фибриногена и фибринолитической активности, а также ряда других факторов про- и антикоагулянтного действия в составе форменных элементов крови. Согласно неоднократно поступающей информации, ВСК выступает в качестве наиболее быстро реагирующего показателя на действие максимально низких концентраций адреналина, колеблющихся в пределах 1 g. В то же время отмеченные выше классические регуляторы этого процесса не проявляют признаков мобилизованности и ожидаемого активного вовлечения в различные этапы развития процесса гемокоагуляции [27, 28]. Описанный феномен является доказательством существования многочисленных до сих пор не выявленных ингредиентов системы свертывания крови, наделенных, по всей вероятности, исключительно высокой энергией реактивности по части своевременного адекватного реагирования на действие эндогенных и экзогенных факторов химической и физической природы. Согласно нашим многочисленным наблюдениям, высказанная точка зрения в настоящее время подкрепляется невторостепенной ролью различных категорий соединений липидной природы и в первую очередь фосфолипидов (ФЛ) нейтральной и кислой природы (НФЛ и КФЛ соответственно), выступающих в качестве активаторов (НФЛ) и ингибиторов (КФЛ) этого процесса [3]. В связи с отмеченным еще в 50-60-х годах прошлого столетия была констатирована принципиально новая научная информация, касающаяся про- и антикоагулянтной роли отдельных представителей гликолипидов [30,50] и ФЛ [32,33]. Одним из частных проявлений вышеотмеченного являются феномены, развивающиеся с участием указанных соединений при физиологически и патологически протекающей беременности [31,48,49]. Основным метаболическим механизмом подключения факторов липидной природы признается их стимулирующее воздействие на активность ферментативных процессов различной направленности [12,16], в частности на уровне микросомального аппарата клетки [8-10], трансдукцию внешнего сигнала внутрь клетки [11,13], катализ процессов клеточного роста и размножения [4,5], регенерацию утраченных структурно-организационных элементов [6, 7].

В серии затронутых вопросов невторостепенным представляется интерес к изучению особенностей превращений предшественников адреналина, каковым, в частности, является аминокислота тирозин и ее разновидности, трансформирующиеся в этот гормон, обладающий мощным прокоагулянтным действием. В подобной постановке вопроса значительный интерес представляют 3 синтетические разновидности изопропилтирозина под кодовыми названиями Н-30, H-31 и Н-32, синтезированные доктором хим. наук В.О. Топузяном в Научно-технологическом центре органической и фармацевтической химии НАН РА. Согласно своим структурным особенностям, отраженным на рис. 1-3, Н-30 представляет собой бензиламид-N-бензоил-О-изопропил-б,в-дегидротирозин, H-31 – анилид-N-бензоил-О-изопропил-б,в-дегидротирозин, а Н-32 – 3-гидроксипропиламид-N-бензоил-О-изопропил-б,в-дегидротирозин. 

Рис. 1

Рис.2

Рис.3

Таким образом, становятся очевидными структурные расхождения между тремя изученными нами синтетическими препаратами, скрывающиеся в наличии бензиламидной группировки в Н-30, анилидной в H-31 и 3-гидроксипропиламидной в Н-32. Что касается остальной части структурной организации исследованных соединений, то во всех случаях она идентична и представлена N-бензоил-О-изопропил-б,в-дегидротирозином. Приведенные расхождения в формулах изученных препаратов сообщают им интересные в химическом понимании индивидуальные особенности, выступающие в роли главных причинно-следственных характеристик, обусловливающих природу функциональной активности каждого из них в отдельности.

Материал и методы

Исследования проводили на белых крысах-самцах массой 180-200 г, содержавшихся в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе и голодавших в течение 12 ч перед взятием их в эксперимент. Получение контрольной плазмы производили из крови венозного узла проколом шприцом в месте слияния подключичной и верхней полой вен по биссектрисе прямого угла, образуемого передней лапой и торсом при крестообразной фиксации белых крыс на станках для мелких животных. Умерщвление последних методом декапитации производили под легким эфирным наркозом. Удаление мозга, печени, сердца и почек, их декапсулирование и освобождение от кровеносных сосудов, а также приготовление тканевых срезов осуществляли в холодных условиях в максимально ограниченные промежутки времени. Определение контрольной ТА, основанное на изменениях протромбинового времени, производили сейчас же по завершении приготовления срезов исследованных тканей [28,29]. Регистрацию особенностей действия 0.1, 0.3 и 0.5 мл 0.01 М растворов поименованных выше вновь синтезированных физиологически активных соединений на ТА исследованного нами биологического материала производили после его 2-часовой инкубации в среде трис-HCI буфера при Т^о= 37^оС и рН = 7.4.

Результаты и обсуждение

Данные, отраженные в табл., свидетельствуют о мощном антикоагулянтном действии испытанных препаратов, выразившемся в значительном падении ТА мозговой ткани в результате 2-часовой инкубации ее срезов в указанной буферной среде в присутствии 0.1 , 0.3 и 0.5 мл 0.01 М растворов исследованных соединений.                

Примечательна при этом зависимость степени выраженности функциональной активности от дозы примененного активного начала, которая не характеризовалась тем не менее многократным изменением биологического эффекта в ту или другую сторону в полном соответствии с количеством примененного препарата. Сравнительный анализ полученного нами фактического экспериментального материала позволяет заключить о большей степени результативности сдвигов ТА мозговой ткани, регистрируемой при использовании препарата Н-30. Как вытекает из приведенного демонстрационного материала, аналогичная закономерность была прослежена под действием использованных доз последнего и на примере ТА почечной ткани. Что касается печеночной и миокардиальной тканей, то ингибирование  ТА в них при использовании известных концентраций препарата Н-30 происходило в значительно меньшей степени на фоне и без того низкого уровня этого показателя в контроле (К).

 Эффективность действия наименьшей дозы препаратов H-31 и Н-32, в результате 2-часовой инкубации исследованного биологического материала характеризовалась падением ТА с различной степенью выраженности. Отмеченный сдвиг под действием препарата H-31

Таблица

Особенности изменения тромбопластической активности (ТА) в сек протромбинового времени мозговой (1), печеночной (2), миокардиальной (3) и почечной (4) тканей белых крыс в контроле (К) и после их 

2-часовой инкубации в среде трис-HCl буфера (Т-37^o, рН-7.4) в присутствии 0.1, 0.3 и 0.5 мл 0.01 М растворов синтетических препаратов Н-30, Н -31 и Н-32

 Примечание. n=29;  сдвиги ТА во всех случаях статистически достоверны; знак “- ” – показатель понижения ТА в %

оказался наиболее демонстративным в отношении ТА печеночной и мозговой тканей, затем миокардиальной и, наконец, почечной ткани. Что касается препарата Н-32, то ингибирующее действие его в дозе 0,1 мл на ТА наиболее отчетливо проявлялось в почечной ткани и в значительно низкой степени в пределах равных величин на примере миокардиальной и печеночной тканей. В то же время инкубирование указанных тканей в присутствии 0.3 и 0.5 мл 0.01 М растворов препаратов H-31 и Н-32, хотя и характеризуется однонаправленностью сдвигов ТА в сторону падения, однако степень его выраженности оказывалась несравненно ниже той, что констатировалась под действием наименьшей дозы (0.1 мл 0.01 М раствора). Сравнительная оценка полученных результатов позволяет в очередной раз признать правомерность концепции проф. Е.Б. Бурлаковой [14, 15], подчеркивающей исключительно высокий уровень результативности сверхнизких доз факторов химической и физической природы, в том числе физиологически активных соединений и лекарственных препаратов. Особый интерес представляют ультразаниженные концентрации последних, достигающие подчас уровней 10^-12 М – 10^-18 М, а то и единичных молекул исследуемого активного начала. Выдвинутые положения нашли свое отчетливое подтверждение в многочисленных клинико-экспериментальных исследованиях К.Г. Карагезяна и сотр. [32-46, 48-53] при различных экстремальных и болезненных состояниях организма и служат основанием к развитию их в рамках затронутой концепции применительно к различным звеньям свертывающей системы крови.  Вместе с тем отсутствие однотипности в степени выраженности ингибирующего действия одной и той же дозы примененного синтетического препарата на ТА различных тканевых систем организма служит основанием к своеобразной интерпретации отмеченных феноменов. Вданном случае, как нам представляется, необходимо учитывать своеобразие структурных особенностей данной биологической системы, по особому взаимодействующей с примененными нами активными началами, создающими в каждом конкретном случае сугубо специфическую взаимосвязь и взаимообусловленность между этими активно контактирующими сторонами.

Таким образом, становится очевидным высказанное нами предположение о зависимости антикоагулянтной активности примененных синтетических препаратов от особенностей их химического строения и структурно-функциональной специфики объектов исследования.

Установленный факт дозо-зависимости степени выраженности антисвертывающего эффекта от примененного активного начала максимально созвучен с концепцией Е.Б. Бурлаковой об исключительной результативности сверхнизких доз факторов химической и физической природы в том числе лекарственных препаратов и физиологически активных соединений.

Литература

1. Бунятян Г.Х. О неодновременном образовании условной связи на различные звенья обмена веществ. Тез. докл. науч. сессии, посвященной вопросам высшей нервной деятельности и компенсаторным приспособлениям. Ереван, 1953, с. 9-12.
2. Бунятян Г.Х. Карагезян К.Г. Условнорефлекторные сдвиги некоторых сторон свертывающей системы крови. ДАН СССР, 1954,  т. XCIX, 5, c. 831-833.
3. Бунятян Г.Х., Казарян Б.А., Карагезян К.Г., Гулян Э.А. К вопросу о проникновении g-аминомасляной кислоты через гематоэнцефалический барьер. ДАН Арм. ССР, 1965, т. 40, 5, c. 289-295.
4. Бурлакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз.  Вестник РАН, 1994, т.64, 5, c. 425-431.
5. Бурлакова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов  низкой  интенсивности. Рос. хим. журнал, 1999а,  т.  XLIII, 5, c. 3-11.
6. Бурлакова Е.Б. Действие фенoзана и экзогенного ацетилхолина на ацетилхолинэстеразу и систему липидной пероксидации в мембранах клеток головного мозга. Рос. хим. журнал, 1999б,  т.  XLIII, 5, c. 63-71.
7. Бурлакова Е.Б., Джалябова М.И., Гвахария В.О. и др. Влияние липидов мембран на активность ферментов. В кн.: Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М., 1982, c. 113-140.
8. Бурлакова Е.Б., Джалябова М.И., Молочкина Е.М. Регуляция активности микросомального фермента фосфолипидом in vivo. ДАН СССР, 1976, т. 227, 4. c. 991-994.
9. Бурлакова Е.Б., Джалябова М.И., Кобляков В.А. и др. Нарушения в регуляции активности микросомальных ферментов липидами при химическом канцерогенезе печени. ДАН СССР, 1978, т. 241, 2, c. 477-480.
10. Бурлакова Е.Б., Гвахария В.О., Глущенко Н.Н., Дупин А.И. Исследование роли липидов в регуляции активности микросомальной глюкозо-6-фосфатазы при модификации микросом in vivo и in vitro.  Биохимия, 1979, т. 44,  6, c. 1111-1116.
11. Бурлакова Е.Б. Роль липидов в передаче информации в клетке. Сб.: Биохимия липидов и их роль в обмене веществ.  М., 1981, c. 23-25.
12. Бурлакова Е.Б., Архипова Г.А., Голощапов А.Н. и др. Мембранные липиды как переносчики информации. В кн.: Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М., 1982, c. 74-83.
13. Бурлакова Е.Б. О возможной роли свободнорадикального механизма в регуляции размножения клеток.  Биофизика, 1967, т. 12, 1, c. 82-88.
14. Бурлакова Е.Б., Эмануэль Н.М. Роль антиокислителей в физико-химических процессах регулирования роста клеток. В кн:. Физико-химические основы авторегуляции в клетках.  М., 1965, т. 44, c. 45.
15. Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., Ружинская Н.Н. Изменение антиокислительной активности липидов печени в процессе ее регенерации после частичной гепатэктомии. Изв. АН СССР. Сер. биол., 1971, 1, c. 134-136.
16. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина Е.М. и др. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М., 1975, с. 214-217.
17. Едоян А.Р., Карян Ш.С., Едоян Л.А. и др. Эффекты сочетанного применения сверхмалых доз кальциевого преципитата дрожжевой низкомолекулярной двуспиральной РНК с тиосульфатом натрия на метаболизм жирных кислот головного мозга белых крыс с аллоксановым диабетом. Современные вопросы сахарного диабета. Материалы VII ежегодной научной сессии. Ереван, 2003, c. 62-63.
18. Едоян А.Р. Специфика корригирующего действия сверхнизких доз факторов химической и физической природы при нарушениях метаболизма фосфолипидов у белых крыс с моделированным аллоксаном сахарным диабетом. Дис…. канд. биол. наук. Ереван, 2004, 145 c.
19. Едоян Л.В., Аганянц М.А., Астабатян М.А. и др. Лазерное облучение сверхнизкой интенсивности при нарушениях гликолипидного обмена у аллоксан-диабетических белых крыс. XI Международная конференция по химии органических и элементоорганических пероксидов. М., 2003, c. 181-182.
20. Едоян Л.В., Карян Ш.С., Едоян А.Р., Карагезян К.Г. Особенности действия сверхмалых доз кальциевого преципитата двуспиральной РНК при нарушении углеводного и фосфолипидного метаболизма у аллоксандиабетических белых крыс.  Информационные технологии и управление, Ереван, 2003, т. 2, c. 212-218.
21. Едоян Л.В. Качественно-количественные нарушения фосфолипидов субклеточных образований гепатоцитов аллоксандиабетических белых крыс и корригируюшее действие сверхнизких доз факторов химической и физической природы. Автореф. дис …. канд. биол. наук.  Ереван, 2004, 22 с.
22. Енгибарян А.А., Карагезян К.Г., Овакимян С.С., Мелкумян А.В. Комбинированное применение витамина Е и нуклеината натрия в нормализации фосфолипидного состава и перекисного окисления липидов миокарда при его экспериментальном инфаркте. Мед. наука Армении НАН РА, 1996, т. XXXVI, 1-2, с. 82-87.
23. Казарян А.В. Особенности нарушений фосфолипидного обмена, процессов свободнорадикального окисления, свертываемости крови и эффективность механизмов их корригирования при моделированном аллоксаном сахарном диабете. Дис…. канд. биол. наук, Ереван, 2006, 134 с.
24. Карагезян К.Г. Неодновременные сдвиги в системе свертывания крови при условнорефлекторном возбуждении и торможении. ДАН Арм. ССР. 1955, т. XX,  1, с. 27-32.
25. Карагезян К.Г. Неодновременное развитие условной связи и внутреннего торможения на отдельные процессы свертывающей системы крови. Тез докл. VI науч. сессии аспирантов и клин. ординаторов, 1954, Ереван, с. 3-5.
26. Карагезян К.Г., Саакян С.С. К вопросу действия g-аминомасляной кислоты (ГАМК),  адреналина и инсулина на некоторые стороны системы свертывания крови. Тез. докл. II Всесоюз. конф. по проблемам свертывания крови, 1966,  Баку, с. 128-129.
27. Карагезян К.Г. Безусловнорефлекторные и условнорефлекторные сдвиги некоторых сторон системы свертывания крови и углеводного обмена при воздействии различных доз адреналина. ДАН СССР, 1958, т. 118, 1, с. 142-145.
28. Карагезян К.Г. Сдвиги времени свертывания крови и содержания фибриногена под действием подпороговых, пороговых и массивных доз адреналина при положительном условноадреналиновом рефлексе и внутреннем торможении. Вопр. биохимии, 1960, Ереван, т. 1, с. 119-127.
29. Карагезян К.Г., Саакян С.С. Артерио-венозная разница свертываемости, протромбинового времени и тромбопластической активности крови у собак под действием различных доз адреналина  и g-аминомасляной кислоты. Вопр. биохимии мозга, Ереван, 1964, т. 1, с. 163-171.
30. Карагезян К.Г. Изменения в содержании фосфолипидов головного мозга и печени белых крыс в условиях действия g-аминомасляной кислоты. Ж. эксп. и клин. медицины, 1968, Ереван, т, 8, 1. с. 3-10.
31. Карагезян К.Г., Овакимян С.С., Тевосянц А.В. Роль фосфолипидов в активировании и торможении процесса свертывания крови. ДАН СССР, 1971, т. 201, 2, с. 486-489.
32. Карагезян К.Г., Овакимян С.С., Тевосянц А.В. Эффекты этаноламинфосфатидов и серинфосфатидов на отдельные звенья свертывающей системы крови. ДАН СССР, 1971, т. 201, 3, с. 733-736.
33. Карагезян К.Г. Тевосянц А.В. Изменения в некоторых звеньях свертывающей системы и обмена фосфолипидов крови  при физиологически протекающей беременности. Биол. ж. АН Арм. ССР, Ереван, 1970, т. XXIII, 12, с. 19-24.
34. Карагезян К.Г., Едоян А.Р., Карян Ш.С., Едоян Л.В. Особенности нормализующего действия сочетанного применения сверхмалых доз кальциевого преципитата двуспиральной РНК с тиосульфатом натрия на метаболизм жирных кислот головного мозга белых крыс с аллоксановым диабетом. ДНАН РА, 2003, т.103, 4, с.336-341.
35. Карагезян К.Г, Мелкумян А.В., Геворкян Д.М. и др. Особенности нарушений молекулярных механизмов регуляции резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу и формирования гипоксического синдрома при остром крупноочаговом инфаркте миокарда. Вестник хирургии Армении, 1995, 3, с. 57-63.
36. Карагезян К.Г, Сафарян М.Д., Мелкумян А.В. и др. Роль молекулярно-биологических и биохимических нарушений метаболизма фосфолипидов в патогенезе экспериментального туберкулезного воспаления легких и формировании генерализованного гипоксического синдрома на этом фоне. Мед. наука Армении НАН РА, 1995, т.  XXXV, 1-2, с. 75-78.
37. Карагезян К.Г., Мелкумян А.В., Геворкян Д.М. и др. Гипоксический синдром в патогенезе расстройств резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу в клинике острого крупноочагового инфаркта миокарда. Мед. наука Армении НАН  РА, 1995, т. XXXV, 1-2, с. 80-87.
38. Карагезян К.Г, Мелкумян А.В., Сафарян М.Д., Карагезян М.К. Особенности нарушений обмена фосфолипидов в молекулярных механизмах патогенеза экспериментального туберкулезного воспаления легочной ткани и формирование генерализованного гипоксического синдрома. Вестник хирургии Армении, 1996, 1, с. 89-94.
39. Карагезян К.Г., Казарян А.В., Овакимян С.С. и др. Особенности физиологической активности вновь синтезированного препарата кумариновой природы в регуляции тромбопластической активности мозговой ткани белых крыс. VI Съезд аллергологов и иммунологов СНГ. Аллергология и иммунология, 2006, М., т. 7, 1, с. 153.
40. Карагезян К.Г., Бдоян О.К., Мелкумян А.В. и др. Особенности течения перекисеобразовательного процесса в микросомальной фракции печеночной ткани белых крыс при адреналин-модулированной гипергликемии. Мед. наука Армении НАН РА, 2007, т. XLVII, 2, с. 38-43.
41. Карян Ш.С., Акопян Г.С., Захарян А.Р. и др. Этиопатогенетические особенности срывов антирадикальной защиты клетки при моделировании аллоксанового диабета у белых крыс и возможные механизмы их упорядочения. I Всероссийская конференция по иммунотерапии. Сочи, 2003, т. 5, 1, с. 97.
42. Карян Ш.С. Особенности антирадикального действия сверхнизких доз физиологически активных соединений и лазерного облучения при аллоксановом диабете. Автореф. дис. ….. канд. биол. наук, Ереван, 2004, 23 с. 
43. Мелкумян А.В., Бдоян О.К., Тер-Григорян А.С. и др. Особенности нарушений фосфолипидов в мозговой и печеночной тканях белых крыс при оксидативном стрессе, моделированном различными сроками голодания. Мед. наука Армении НАН РА,  2006, т. XLVI, 4, с. 9-15.
44. Мелкумян А.В. Дезинтеграция фосфолипидного компонента и нарушения антирадикальной защиты при гипоксических состояниях новорожденных и пути по их эффективной коррекции и нормализации. VII Международная конференция БИОАНТИОКСИДАНТ, М., 2006, с. 191-193.
45. Мелкумян А.В. Особенности нарушений резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу как тяжелейшее осложнение гипоксий новорожденных и корригирующее действие тиосульфата натрия на этом фоне. ДНАН РА, Ереван, 2007,  т. 107, 3, с. 279-284.
46. Мелкумян А.В. Динамика качественно-количественных изменений фосфолипидов в крови новорожденных с гипоксическим синдромом и особенности терапевтической эффективности сверхнизких доз тиосульфата натрия на этом фоне. Мед. наука Армении НАН РА, Ереван, 2007, т. XLVII, 3, с. 64-68.
47. Предтеченский В.Е., Боровская В.М., Марголина Л.Т.  Руководство по лабораторным методам исследования. М., 1950.
48. Тевосянц А.В. Состояние некоторых сторон свертывающей и противосвертывающей систем крови при физиологически протекающей беременности. Биол. ж. АН Арм. ССР, Ереван, 1970, т. XXIII, 6, с. 106-108.
49. Тевосянц А.В. Изменения некоторых сторон системы свертывания крови  и содержания в ней фосфолипидов при физиологически протекающей и осложненной ранним токсикозом беременности. Биол. ж. АН Арм. ССР, Ереван, 1970, т. XXIII, 10, с. 102-104.
50. Buniatian H. Ch. Studies of the role of gamma-amminobutyric acid in carbohydrates metabolism, Yerevan, 1961.
51. Ghazaryan A.V., Hovakimyan S.S., Karagyozyan M.K. et al. “Peculiarities of the Anticoagulant Properties for the Newly Synthesized Preparations of Coumarin-Related Compounds”, in: Cardiovascular & Hematological Disorders.  Drug Targets, 2007, v.7, 3, p. 270 – 275.
52. Karageuzyan K.G., Ghazaryan A.V., Hovakimyan S.S.  et al. Peculiarities of the physiological activity of newly synthesized preparations of coumarin nature on rat brain tissue thromboplastic activity. International J. on Immunoreabilitation, Tenerife, 2006, v.7, 3, p. 114.
53. Karageuzyan K.G., Sekoyan E.S., Hovsepyan L.M. et al. Peculiarities of rat brain and erythrocytes phospholipids composition disorders at alloxan induced hyperglycemia and effects of RNA calcium precipitate on this background. Международный симпозиум под эгидой ЮНЕСКО “Проблемы биохимии, молекулярной, радиационной биологии и генетики”, посвященный 100-летию академика Н.М. Сисакяна, Ереван, 2007, с. 75. 

Вопросы, ответы, комментарии